В природе мальтоза образуется при ферментативном расщеплении крахмала и гликогена в животном и растительном организмах. 38 Это происходит под действием амилолитических ферментов (β-амилаз). 6

В свободном состоянии мальтоза обнаруживается главным образом в богатых крахмалом прорастающих семенах растений, например в проростках ячменя и других злаков. 6 Также она найдена в томатах, в пыльце и нектаре ряда растений. 3

Кроме того, мальтоза обнаруживается в мёде и нектаре цветов. 6

Расщепление мальтозы на две молекулы глюкозы происходит под действием α-глюкозидазы (мальтазы), которая содержится в пищеварительном соке позвоночных животных, в проросших зёрнах, плесневых грибах и дрожжах. 6