Основные различия между рестриктазами разных классов заключаются в специфике сайтов узнавания и месте расщепления молекулы ДНК: 34

• Рестриктазы первого класса способны узнавать определённую последовательность нуклеотидов и разрезать молекулу ДНК в произвольном месте, недалеко от сайта рестрикции. 3
• Рестриктазы второго класса узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают молекулу ДНК в определённом месте, внутри сайта рестрикции. 3 Такие ферменты распознают полиндромные последовательности нуклеотидов, которые одинаково считываются в обоих направлениях. 3
• Рестриктазы третьего класса узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают молекулу ДНК, отступив несколько нуклеотидов от сайта узнавания. 3 При этом могут образовываться фрагменты ДНК с «тупыми» (ровными) или «липкими» (выступающими) концами. 3 Ферменты этого класса могут узнавать несимметричные сайты. 3