Существуют следующие типы эндонуклеаз рестрикции:

1. Эндонуклеазы рестрикции первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двуцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке. 14
2. Эндонуклеазы рестрикции второго типа (например, EcoRI, XbaI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную цепь ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. 1
3. Эндонуклеазы рестрикции третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двуцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). 1