Некоторые экспериментальные методы, которые применяются для определения константы Михаэлиса:

1. Алгоритм эксперимента: 1

2. Подготовить растворы разной концентрации субстрата (например, от 0,1 мМ до 10 мМ). 1

3. Подготовить рабочие растворы фермента. 1

4. Добавить фермент к каждому из растворов субстрата. 1 Рекомендуется использовать несколько параллельных проб, чтобы повысить точность результатов. 1

5. Инкубировать реакционные смеси при определённой температуре и времени (обычно время инкубации составляет от нескольких секунд до нескольких минут, в зависимости от фермента). 1

6. Остановить реакции добавлением раствора, который остановляет реакцию, например, раствор HCl. 1

7. Измерить концентрацию продукта реакции (например, образование NADH) в каждой реакционной смеси через определённый интервал времени с помощью спектрофотометрии. 1

8. Построить график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. 1 Найти максимальную скорость реакции (Vmax) и концентрацию субстрата, при которой скорость реакции достигает половины Vmax. 1

9. Рассчитать значение константы Михаэлиса, используя уравнение Михаэлиса-Ментен. 1

10. Метод Лайнуивера-Берка. 35 Это способ линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен, то есть перевод гиперболической зависимости в линейную. 3 Для этого уравнение Михаэлиса-Ментен представляют в двойных обратных координатах, и из уравнения линейной регрессии определяют константы. 5

11. «Прямой график» Эйзенталя-Боудена. 5 Каждой начальной концентрации субстрата соответствует значение начальной скорости. 5 Значения с обратным знаком откладывают на оси абсцисс, на оси ординат — значения. 5 Через полученные пары точек проводят прямые, пересекающие координатные оси. 5 Проекция общей точки пересечения прямых на горизонтальную ось равна КМ, а на вертикальную — Vmax. 5

12. Метод Диксона. 5 Согласно этому методу, точку начала координат соединяют прямыми линиями с точками на кривой уравнения Михаэлиса-Ментен. 5 Прямые отсекают на горизонтальной линии одинаковые отрезки, длина которых равна КМ. 5