Какие экспериментальные методы применяются для определения константы Михаэлиса?

Некоторые экспериментальные методы, которые применяются для определения константы Михаэлиса:

1. Алгоритм эксперимента: otvet.mail.ru

2. Подготовить растворы разной концентрации субстрата (например, от 0,1 мМ до 10 мМ). otvet.mail.ru

3. Подготовить рабочие растворы фермента. otvet.mail.ru

4. Добавить фермент к каждому из растворов субстрата. otvet.mail.ru Рекомендуется использовать несколько параллельных проб, чтобы повысить точность результатов. otvet.mail.ru

5. Инкубировать реакционные смеси при определённой температуре и времени (обычно время инкубации составляет от нескольких секунд до нескольких минут, в зависимости от фермента). otvet.mail.ru

6. Остановить реакции добавлением раствора, который остановляет реакцию, например, раствор HCl. otvet.mail.ru

7. Измерить концентрацию продукта реакции (например, образование NADH) в каждой реакционной смеси через определённый интервал времени с помощью спектрофотометрии. otvet.mail.ru

8. Построить график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. otvet.mail.ru Найти максимальную скорость реакции (Vmax) и концентрацию субстрата, при которой скорость реакции достигает половины Vmax. otvet.mail.ru

9. Рассчитать значение константы Михаэлиса, используя уравнение Михаэлиса-Ментен. otvet.mail.ru

10. Метод Лайнуивера-Берка. studfile.net poznayka.org Это способ линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен, то есть перевод гиперболической зависимости в линейную. studfile.net Для этого уравнение Михаэлиса-Ментен представляют в двойных обратных координатах, и из уравнения линейной регрессии определяют константы. poznayka.org

11. «Прямой график» Эйзенталя-Боудена. poznayka.org Каждой начальной концентрации субстрата соответствует значение начальной скорости. poznayka.org Значения с обратным знаком откладывают на оси абсцисс, на оси ординат — значения. poznayka.org Через полученные пары точек проводят прямые, пересекающие координатные оси. poznayka.org Проекция общей точки пересечения прямых на горизонтальную ось равна КМ, а на вертикальную — Vmax. poznayka.org

12. Метод Диксона. poznayka.org Согласно этому методу, точку начала координат соединяют прямыми линиями с точками на кривой уравнения Михаэлиса-Ментен. poznayka.org Прямые отсекают на горизонтальной линии одинаковые отрезки, длина которых равна КМ. poznayka.org