При окраске по Цилю-Нильсену важно соблюдать последовательность действий, потому что это позволяет дифференцировать кислотоустойчивые микроорганизмы от не обладающих этим свойством. 12

Метод основан на том, что при последующей кратковременной обработке кислотой одни микробные клетки прочно удерживают краситель и не обесцвечиваются в растворе кислот, другие — теряют цвет. 1 Это даёт возможность отличить кислотоустойчивые бактерии от не обладающих этим свойством. 1

Затем при дальнейшем докрашивании красителем другого цвета (например, метиленовой синью) некислотоустойчивые микроорганизмы приобретают цвет дополнительного красителя, а кислотоустойчивые сохраняют цвет основного красителя (фуксина Циля). 1