Некоторые микроорганизмы не поддаются классификации по методу Грама по разным причинам, среди них:

• Необычная структура клеточной стенки. 1 Например, представители рода гарднерелла имеют необычную грамположительную структуру, из-за которой окрашиваются как грамотрицательные или грамвариабельные. 1
• Непрочные или покрытые жирами клеточные стенки. 2 Такие бактерии могут одновременно окрашиваться в фиолетовый и розовый цвет в пределах одной клетки, либо клетки одного и того же вида могут окрашиваться по-разному в одном мазке. 2
• Кислотоустойчивые бактерии. 3 Их трудно окрашивать по Граму, так как клеточная стенка содержит большое количество липидов и восков. 3
• Мелкие и тонкие бактерии. 2 Например, трепонемы, хламидии и риккетсии плохо поддаются окрашиванию по Граму. 2
• Возраст культуры и предварительная обработка антибиотиками. 1 На результаты окрашивания может влиять возраст бактерий и их предварительная обработка. 1

Для точного определения некоторых микроорганизмов могут понадобиться более специализированные методы, такие как окраска по Цилю-Нильсену, наблюдение за ростом культуры, тест TSI (тройной сахар железа), генетическое тестирование. 2