Некоторые причины, по которым некоторые бактерии остаются недифференцируемыми при окраске по Граму:

• Наличие у грамположительных бактерий ненасыщенных жирных кислот. 1 Они могут связываться с йодом, что делает клеточную стенку непроницаемой для нейтрального спирта. 1 В результате спирт не может проникнуть в клетку и обесцветить краситель. 1
• Различие в кислотно-основных свойствах протоплазмы. 1 Изоэлектрическая точка грамотрицательных бактерий более смещена в щелочную среду, в то время как йод в составе протравы смещает pH бактерий в кислую сторону. 1
• Наличие на клеточной стенке грамположительных бактерий комплекса белка с рибонуклеатом магния. 1 После удаления этого комплекса повторное окрашивание показывает бактерию как грамотрицательную. 1
• Кислотоустойчивость бактерий. 3 Клеточная стенка некоторых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). 3 Подобные бактерии трудно окрашивать по Граму, для их окраски применяют метод Циля-Нильсена. 3