Грамотрицательные бактерии хуже окрашиваются по методу Грама, чем грамположительные, из-за особенностей строения их клеточной стенки. 13

Грамположительные бактерии имеют более толстую клеточную стенку толщиной 50 нм и более, 40–80% её составляет пептидогликан. 1 Под действием растворителя стенки грамположительных бактерий закрываются, предотвращая обесцвечивание. 2

Грамотрицательные бактерии имеют более тонкую клеточную стенку толщиной 15–20 нм, пептидогликан составляет 5–10% массы клеточной стенки. 1 При использовании растворителя липидный слой грамотрицательных организмов растворяется, в результате чего бактерии теряют первичную окраску. 2

После обесцвечивания грамположительные бактерии остаются пурпурными, а грамотрицательные клетки вновь окрашиваются при добавлении контрастного красителя, приобретая розовый или красный цвет. 2