Роль ДНК-топоизомераз в процессе репликации ДНК заключается в том, что они, находясь перед репликативной вилкой, разрезают молекулу ДНК для облегчения её расплетания и раскручивания. 23 После этого непрерывность молекулы восстанавливается. 2

ДНК-топоизомеразы действуют путём создания временного однонитевого или двунитевого разрыва в молекуле ДНК, проведения сквозь разрыв другого, целого сегмента цепи и воссоединения цепи в месте разрыва. 2 В результате такого ферментативного акта целостность цепей сохраняется, но их топологическое состояние может измениться. 2

Топоизомераза I путём одноцепочечного разрыва создаёт шарнир, вокруг которого молекула ДНК, находящаяся перед вилкой, может свободно вращаться. 2 Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения. 2 Топоизомераза II вносит временные разрывы в обе комплиментарные цепи ДНК, пропускает двухцепочечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяет разорванные концы. 2 В результате за один акт снимаются два сверхвитка. 2