Для протекания темновой фазы фотосинтеза необходимы следующие вещества:

• АТФ (аденозинтрифосфат) — богатое энергией вещество, которое образуется в ходе световой фазы фотосинтеза; 15
• НАДФ·Н2 (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) — восстановитель, который поставляет ионы водорода, необходимые для восстановления углекислого газа. 5

Также необходимо наличие сахаров, к которым будет присоединяться атом углерода из молекулы СО₂. 2 Источником сахаров для прорастающих растений является эндосперм — запасные вещества, которые находятся в семени и получены от родительского растения. 2

Реакции темновой фазы проходят в строме (матриксе) хлоропластов и не зависят от наличия света, так как необходимая для них энергия уже запасена в форме АТФ. 2