Некоторые ограничения светового микроскопа при исследовании живых клеток:

• Ограничение по размеру объекта. 4 Длина волны света накладывает запрет на изучение объектов, которые существенно меньше длины волны. 4 Например, при использовании белого света разрешение светового микроскопа составляет порядка 0,5 мкм. 4
• Трудность с визуализацией мелких структур. 2 Даже при использовании самого коротковолнового видимого света (фиолетового) разрешение светового микроскопа составляет около 200 нм. 2 При такой разрешающей способности видны только самые крупные компоненты клеток — ядро, пластиды, вакуоли, митохондрии, клеточные стенки. 2
• Необходимость поддержания постоянного расстояния между живыми клетками и передней частью объектива микроскопа. 5 Даже небольшое смещение (0,25–0,5 мкм) может привести к тому, что образец окажется полностью не в фокусе и данные будут бесполезны. 5
• Влияние красителей. 2 Большинство красителей, которые используют для окрашивания клеток, токсично для них и вызывает гибель. 2 Для живых клеток применяют только прижизненные красители, которые не токсичны. 2
• Влияние теплового дрейфа. 5 Сосуд для образцов, среда для погружения и отбора проб, а также сами ячейки подвержены тепловому расширению или сжатию при изменении температуры окружающей среды на доли градуса. 5