ДНК-полимераза работает, осуществляя полимеризацию нуклеотидов в цепь, комплементарную матричной. 1

Один акт полимеризации можно разделить на несколько этапов: 1

1. Комплекс (Mg/дезоксирибонуклеотидтрифосфат) поступает в активный центр фермента и образует водородные связи с нуклеотидом матрицы (на данном этапе осуществляется первый раунд коррекции полимеризации). 1
2. Если нуклеотиды комплементарны, то образуется комплекс, в котором нуклеотид матрицы, 3’-концевой нуклеотид нарастающей цепи и новый нуклеотидтрифосфат образуют комплекс с правильной ориентацией всех молекул, а в связи с этим стабильный. 1 Если нуклеотидтрифосфат не комплементарен, то стабильный комплекс не образуется и, следовательно, этот нуклеотид отсоединяется и уходит из активного центра. 1
3. После присоединения нового нуклеотида происходит второй этап коррекции полимеризации. 1 Если новоприсоединённый нуклеотид не комплементарен, то следующий не поступает в активный центр фермента и ДНК-полимераза своей 3’-5’-нуклеазной активностью отщепляет неправильный нуклеотид. 1 Далее цикл повторяется. 1

ДНК-полимераза может только наращивать цепь ДНК, начать же синтез ДНК с нуля она не в состоянии, для начала её работы требуется затравка. 2 В качестве затравки может выступать фрагмент ДНК или РНК. 2

Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. 3 Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад. 3 Благодаря своей 3'-5'-экзонуклеазной гидролитической активности ДНК-полимераза может исключить неправильный нуклеотид из цепочки и затем вставить на его место правильный, после чего репликация продолжается в нормальном режиме. 3