Оптимальная температура отжига праймеров для получения максимального количества продукта ПЦР зависит от их структуры и обычно варьируется от 55 °C до 72 °C. 1

Некоторые рекомендации по подбору температуры отжига:

• Использовать пары праймеров со сходной температурой отжига. 1 Для пары праймеров с разной температурой отжига выбирать наименьшую при написании программы ПЦР. 1
• Для приблизительного расчёта температуры отжига праймера можно воспользоваться формулой: Tm (°C) = 2 х (A+T) + 4 х (G+C). 1 Однако оптимальная температура отжига может отличаться от расчётной. 1
• В ряде случаев повышать температуру отжига на 3–5 градусов, чтобы повысить специфичность реакции. 1
• Подобрать оптимальную температуру отжига можно с помощью градиентного термоамплификатора. 1

Неправильный выбор температуры отжига может привести либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). 3