Какие этапы включает в себя метод Сэнгера для секвенирования ДНК?

В классическом варианте метод Сэнгера для секвенирования ДНК включает следующие этапы: ru.ruwiki.ru

1. Подготовка реакционной смеси. millab.ru В четырёх пробирках готовят смесь, состоящую из праймера, стандартных дезоксинуклеотидов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), а также малого количества одного из четырёх радиоактивно меченых дезоксинуклеотидов (дидезоксинуклеотидов). ru.ruwiki.ru millab.ru
2. Синтез ДНК. f-genetics.com Молекулу ДНК синтезирует фермент ДНК-полимераза, которая, в соответствии с матрицей, по одному встраивает нуклеотиды в растущую цепь. f-genetics.com Среди всех нуклеотидов имеется 1% «терминирующих», каждый из которых несёт особую флуоресцентную метку. f-genetics.com После встраивания таких нуклеотидов дальнейший синтез цепи становится невозможен. f-genetics.com
3. Образование фрагментов ДНК. ru.ruwiki.ru millab.ru В каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). ru.ruwiki.ru millab.ru
4. Разделение фрагментов по величине. f-genetics.com Синтезированные фрагменты ДНК разделяются под действием электрического поля: чем меньше фрагмент, тем он быстрее движется в геле. f-genetics.com
5. Авторадиография гелей. ru.ruwiki.ru Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК. ru.ruwiki.ru

В современном варианте метод автоматизирован и проводится на специальных приборах, секвенаторах. ru.ruwiki.ru Реакцию проводят в одной пробирке, а результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствующих четырём нуклеотидам. ru.ruwiki.ru millab.ru